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更新時間：2022-09-27 16:13:59 點擊次數：3106 次
1.引物最好在模板 cDNA 的保守區內設計，保守區是不同物種同一基因的相同序列DNA 序列。
2.引物長度一般在15 ～ 30bp之間。引物長度常用的是18 ～ 27bp，過長會導致其延伸溫度大于74℃，不利于PCR反應。
3.引物 GC 含量在40%~60％之 間，Tm 值最好接近68 ～ 72 ℃， GC含量過高或過低都不利于反應起始。上下游引物的GC含量不能相差太大。Tm值計算方法可參考公式Tm=4 (G+C)+2 (A+T) 。
4.引物3’端要避開密碼子的第3位。如擴增編碼區域，引物3’端最后一個堿基不能是密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。
5.引物3’端一般不建議選擇A。當末端堿基為A時，引發錯配的概率增加。
6.堿基要隨機分布。引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，像CCC或GGG，否則容易導致錯誤引發。
7.引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身存在互補序列，容易形成發夾結構。兩引物之間也不應具有互補性，以防止引物二聚體的形成。
引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高。二聚體的形成會降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。
8.引物5’端和中間△G值應該相對較高，而3’端△G值較低。△G值可以反映雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5’端和中間△G值相對較高，而3’端△G值較低的引物。
9.引物的5’端可以修飾，而3’端不可修飾。擴增是由3’端開始的，不能進行修飾，而引物的5’端不影響PCR擴增的特異性,所以可以進行修飾。
10.擴增產物的單鏈不能形成二級結構。在選擇引物位置時，最好避開二級結構區域。
11.引物應具有特異性。引物設計完成以后，應對其進行BLAST比對，不應與其它基因互補。
